本科學(xué)生綜合性實(shí)驗(yàn)報告

　　學(xué)號

　　姓名

　　學(xué)院

　　專業(yè)、班級

　　實(shí)驗(yàn)課程名稱：

　　教師及職稱

　　開課學(xué)期

　　至

　　學(xué)年

　　學(xué)期

　　填報時間×年×月×日

　　云南師范大學(xué)教務(wù)處編印

　　實(shí)驗(yàn)設(shè)計方案

　　實(shí)驗(yàn)序號

　　實(shí)驗(yàn)名稱

　　實(shí)驗(yàn)時間

　　實(shí)驗(yàn)室

　　一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/strong>

　　1、學(xué)習(xí)并掌握小鼠骨髓細(xì)胞染色體的制備方法。

　　2、觀察小鼠染色體的形態(tài)特征,統(tǒng)計細(xì)胞的染色體數(shù)目。

　　3、了解微核發(fā)生的機(jī)制；

　　4、掌握微核實(shí)驗(yàn)的一般程序和實(shí)踐意義；

　　5、掌握對實(shí)驗(yàn)動物進(jìn)行藥物處理的一般程序；

　　6、掌握進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計的一般程序和規(guī)則，并鍛煉實(shí)踐能力。

　　二、實(shí)驗(yàn)原理、實(shí)驗(yàn)流程或裝置示意圖

　　1、骨髓細(xì)胞具有高度的分裂增殖能力。因此可以直接得到中期細(xì)胞而不必象血淋巴細(xì)胞或組織那樣要經(jīng)過體外培養(yǎng)。經(jīng)秋水仙素處理后，分裂增殖中的骨髓細(xì)胞由于紡綞體的形成受到抑制，染色體不能正常趨向兩極而使之停留于中期，同時染色體縮短，輪廓清晰，把收獲的細(xì)胞進(jìn)行低滲，固定處理，使細(xì)胞處于膨脹狀態(tài)，再將細(xì)胞懸液滴在載片上，使細(xì)胞破裂，染色體散開，染色后即可觀察到染色體。

　　2、微核（Micronucleus）：染色單體或染色體的無著絲點(diǎn)斷片，或因紡錘體受損而丟失的整個染色體，在細(xì)胞分裂后期，仍然遺留在細(xì)胞質(zhì)中。末期之后，單獨(dú)形成一個或幾個規(guī)則的次核，被包含在子細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)，因比主核小，故稱為微核。凡能使染色體發(fā)生斷裂或使染色體和紡錘體聯(lián)結(jié)損傷的化學(xué)物，都可用微核試驗(yàn)來檢測。各種類型的骨髓細(xì)胞都可形成微核，但有核細(xì)胞的胞質(zhì)少，微核與正常核葉及核的突起難以鑒別。

　　嗜多染紅細(xì)胞是分裂后期的紅細(xì)胞由幼年發(fā)展為成熟紅細(xì)胞的一個階段，此時紅細(xì)胞的主核已排出，因胞質(zhì)內(nèi)含有核糖體，姬姆薩染色呈灰藍(lán)色，成熟紅細(xì)胞的`核糖體已消失，被染成淡桔紅色。骨髓中嗜多染紅細(xì)胞數(shù)量充足，微核容易辨認(rèn)，而且微核自發(fā)率低，因此，骨髓中嗜多染紅細(xì)胞成為微核試驗(yàn)的首選細(xì)胞群。

　　三、實(shí)驗(yàn)設(shè)備及材料

　　1、材料：小白鼠（2n=40）

　　2、器具：注射器（1ml，5ml各一支）、托盤、解剖剪、鑷子、吸管、離心管、離心機(jī)、載片、濾紙、白紗布小塊等。

　　3、藥品：0.15mg/ml秋水仙素，1%檸檬酸三鈉，固定液（3份甲醇，1份冰乙酸，臨用時現(xiàn)配），Giemsa染液，2.2%檸檬酸鈉，0.01M磷酸緩沖液（PBS）pH6.8。

　　4、生物顯微鏡、解剖剪、鑷子、注射器、載玻片、蓋玻片、塑料吸瓶、吸水紙等。

　　四、實(shí)驗(yàn)方法步驟及注意事項(xiàng)

　　一、小鼠骨髓細(xì)胞染色體標(biāo)本制備與觀察

　　1、處理：用1.5mg/kg秋水仙素腹腔注射處理小鼠（注射量為0.1ml/10g體重）。即用以上配制的秋水仙溶液按每10g體重注射0.1ml。注射后24小時，可以取骨

　　2、處死：斷頸法處死小鼠。剪刀剪開腿部的皮膚，用鑷子夾住小鼠的股骨，剪去股骨周圍的肌肉，將小鼠的兩股骨取出，擦凈股骨上的肌肉。去股骨的髖面，將吸有2.2%檸檬酸三鈉溶液的小注射器的針頭插入，反復(fù)幾次吹出骨髓細(xì)胞，反復(fù)吹打直至股骨呈白色，制成細(xì)胞懸液。

　　3、低滲：將細(xì)胞懸液在1000rpm/min離心5min，棄除上清液，留0.5ml搖勻。向細(xì)胞液中再加入1%的檸檬酸三鈉溶液5ml用吸管輕吹打均勻，在室溫低滲30min。低滲期間，配制固定液，即甲醇：冰醋酸為3:1（v/v)，置4℃冰箱中備用。

　　4.預(yù)固定(1次)：低滲處理后的細(xì)胞懸液離心5分鐘，留1ml原液，搖勻。加入新配制的固定液至6ml，吹打均勻，固定5分鐘，再在1000rpm/min離心3-5min，去掉上清液。

　　5、固定（2次）：沿離心管壁慢慢加入新配制的固定液6ml，用吸管輕輕吹打均勻，室溫下固定5min，1000rpm/min3min，棄去上清；如此反復(fù)固定兩次（共固定3次）。

　　6.根據(jù)管底細(xì)胞量的多少，加入新配制的固定液0.3~0.8ml，用吸管打均勻，使其形成細(xì)胞懸液。

　　7.滴片：將預(yù)冷的載玻片（0℃冰浴），水平或傾斜45°角放置，用吸管吸取細(xì)胞懸液，從約0.5-1m高處滴1~2滴到片子上，用口將其吹干，靜置使其干燥。

　　8.染色：將干燥的玻片放入2ml吉姆薩原液加入40ml磷酸緩沖液（pH6.8）配成的染液中染色20min，用磷酸緩沖液（pH6.8）沖洗，晾干后鏡檢。

　　二、微核試驗(yàn)方法：

　　1、骨髓的制取：斷頸法處死小鼠。用剪刀剪開腿部的皮膚，用鑷子夾住小鼠的股骨，剪去股骨周圍的肌肉，將小鼠的兩股骨取出，擦凈股骨上的肌肉。去股骨的髖面，將吸有0.85%Nacl生理等滲液小注射器的針頭插入，反復(fù)幾次吹出骨髓細(xì)胞。反復(fù)吹打使其混合均勻，制成細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液在1000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，棄除上清液。2、涂片：在離心管中加入少量的小牛血清（約0.3ml)混勻后，按血常規(guī)涂片法涂片，長度約2cm~3cm(涂片時一次涂成）。在空氣中晾干。

　　3、固定：將干燥的涂片放入甲醇液中固定5min。即使當(dāng)日不染色，也應(yīng)固定后保存。

　　4、染色：將固定過的涂片放入Giemsa應(yīng)用液中，染色20min~30min，然后立即用0.1mol/L磷酸鹽緩沖液沖洗。

　　5、封片：用濾紙及時擦干染片背面的水滴，再用雙層濾紙輕輕按壓染片，以吸附染片上殘留的水分，再在空氣中晃動數(shù)次，以促其盡快晾干，然后放入二甲苯中透明5min，取出滴上適量光學(xué)樹脂膠，蓋上蓋玻片，寫好標(biāo)簽。

　　每只動物計數(shù)1000個嗜多染紅細(xì)胞，觀察含有微核的嗜多染紅細(xì)胞數(shù)，微核率以千分率表示。

　　數(shù)據(jù)處理：利用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS的單因素方差分析或t檢驗(yàn)等方法，進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果（如后表）。

　　五、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理方法

　　微核試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計總表1：

　　受試物

　　劑量mg/Kg

　　組別

　　各受試小鼠1000個受檢細(xì)胞中含微核細(xì)胞數(shù)

　　1

　　2

　　3

　　4

　　5

　　6

　　7

　　8

　　對苯二酚

　　120

　　1

　　38

　　33

　　35

　　37

　　34

　　35

　　36

　　30

　　80

　　2

　　28

　　31

　　30

　　32

　　29

　　28

　　33

　　27

　　40

　　3

　　20

　　25

　　21

　　23

　　28

　　26

　　24

　　22

　　秋水仙素

　　3

　　1

　　36

　　33

　　32

　　34

　　35

　　31

　　31

　　37

　　1.5

　　2

　　29

　　25

　　23

　　26

　　24

　　27

　　25

　　24

　　1

　　3

　　24

　　21

　　23

　　20

　　19

　　25

　　22

　　19

　　氯化汞

　　3

　　1

　　22

　　25

　　20

　　26

　　21

　　23

　　22

　　18

　　2

　　2

　　16

　　22

　　21

　　19

　　20

　　18

　　17

　　15

　　1

　　3

　　13

　　17

　　15

　　16

　　14

　　15

　　17

　　13

　　陰性對照蒸餾水

　　3

　　2

　　1

　　4

　　3

　　5

　　3

　　9

　　陽性對照環(huán)磷酰胺

　　40mg/kg體重

　　38

　　44

　　45

　　40

　　36

　　41

　　43

　　39

　　表2

　　對苯二酚對動物骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核發(fā)生率

　　組

　　別

　　劑量

　　動物數(shù)

　　受檢細(xì)胞數(shù)

　　含微核細(xì)胞數(shù)

　　微核率

　　P值

　　(g/kg體重)

　　(只)

　　(個)

　　(個)

　　(‰)

　　受試物

　　120

　　8

　　8000

　　對苯二酚

　　80

　　8

　　8000

　　40

　　8

　　8000

　　溶劑對照（蒸餾水）

　　8

　　8000

　　陽性物對照

　　環(huán)磷酰胺

　　(mg/kg體重)

　　40

　　6．參考文獻(xiàn)

　　[1]孟紫強(qiáng)，阮愛東，桑楠等.SO2污染對小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核的誘發(fā)作用.環(huán)境科學(xué)，20xx，23（4）123-125.

　　[2]孟紫強(qiáng)，桑楠，張波等.二氧化硫體內(nèi)衍生物誘發(fā)小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核的效應(yīng).環(huán)境科學(xué)學(xué)報，20xx，20（2）239-243.

　　[3]耿德貴，王秀琴，劉士旺等.除草劑使它隆對黃鱔細(xì)胞的致突變作用研究.環(huán)境與健康雜志，20xx，17（2）103-105.

　　[4]周曉蓉，李百祥，邱向紅等.小鼠骨髓及肝血中嗜多染紅細(xì)胞微核率的比較.衛(wèi)生毒理學(xué)雜志，1999，13（1）66-67.

　　[5]

　　曹佳.微核實(shí)驗(yàn)在中國的應(yīng)用、發(fā)展與展望.遺傳，20xx，25（1）73-76.

　　二．實(shí)驗(yàn)報告

　　1．實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象與結(jié)果

　　2．對實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象、實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析及其結(jié)論

　　3．實(shí)驗(yàn)總結(jié)

教師評語及評分：

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