質(zhì)粒DNA的提取、純化及檢測(cè)

　　姓名：XXX學(xué)號(hào)：2011001400XX年級(jí)：20xx級(jí)生物基地班 實(shí)驗(yàn)日期：20xx年9月16日—30日組別：6組 同組者：XX

　　一、【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?/strong>

　　1、掌握堿變性提取法提取大腸桿菌中質(zhì)粒DNA的原理和方法。

　　2、學(xué)習(xí)并掌握凝膠電泳進(jìn)行DNA的分離純化的實(shí)驗(yàn)原理。

　　3、學(xué)習(xí)并掌握凝膠的制備及電泳方法。

　　4、學(xué)習(xí)并掌握凝膠中DNA的分離純化方法。

　　二、【實(shí)驗(yàn)原理】

　　1、質(zhì)粒DNA的制備方法

　　質(zhì)粒（Plasmid）是獨(dú)立存在于染色體外、能自主復(fù)制并能穩(wěn)定遺傳的一種環(huán)狀雙鏈DNA分子，分布于細(xì)菌、放線菌、真菌以及一些動(dòng)植物細(xì)胞中，但在細(xì)菌細(xì)胞中含量最多。細(xì)菌質(zhì)粒大小介于1～200Kb之間，是應(yīng)用最多的質(zhì)粒類群，在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)它們利用宿主細(xì)胞的復(fù)制機(jī)構(gòu)合成質(zhì)粒自身的DNA。

　　質(zhì)粒DNA的制備包括3個(gè)步驟：①培養(yǎng)細(xì)菌，使質(zhì)粒DNA大量擴(kuò)增；②收集和裂解細(xì)菌；③分離和純化質(zhì)粒DNA。主要方法包括：堿裂解法：0。2molNaOH+1%SDS；煮沸裂解法：沸水煮沸40秒；SDS裂解法：10%SDS，一般用于質(zhì)粒大量提取。在實(shí)際操作中可以根據(jù)宿主菌株類型、質(zhì)粒分子大小、堿基組成和結(jié)構(gòu)等特點(diǎn)以及質(zhì)粒DNA的用途進(jìn)行選擇。本實(shí)驗(yàn)選擇堿裂解法提取質(zhì)粒DNA。

　　2、質(zhì)粒DNA的提取——堿變性提取法

　　在細(xì)菌細(xì)胞中，染色體DNA和質(zhì)粒DNA均被釋放出來，但是兩者變性與復(fù)性所依賴的溶pH值不同。在pH值高達(dá)12。0的堿性溶液中，染色體DNA的氫鍵斷裂，雙螺旋結(jié)構(gòu)解開而變性；共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA的大部分氫鍵斷裂，但兩條互補(bǔ)鏈不完全分離。因?yàn)樗鼈冊(cè)谕負(fù)鋵W(xué)上是相互纏繞的。當(dāng)用pH值4。6的KAc（NaAc）高鹽溶液調(diào)節(jié)堿性溶液至中性時(shí)，變性的質(zhì)粒DNA可恢復(fù)原來的共價(jià)閉合環(huán)狀超螺旋結(jié)構(gòu)而溶解于溶液中；但染色體DNA不能復(fù)性，而是與不穩(wěn)定的大分子RNA、蛋白質(zhì)—SDS復(fù)合物等一起形成纏連的、可見的白色絮狀沉淀。這種沉淀通過離心，與復(fù)性的溶于溶液的質(zhì)粒DNA分離。溶于上清液的質(zhì)粒DNA，可用無水乙醇和鹽溶液，使之凝聚而形成沉淀。由于DNA和RNA性質(zhì)類似，乙醇沉淀

　　DNA的同時(shí)，也伴隨著RNA沉淀，可利用RNaseA將RNA降解。質(zhì)粒DNA溶液中的RNaseA以及一些可溶性蛋白，可通過酚/氯仿抽提除去，最后獲得純度較高的質(zhì)粒DNA。

　　3、凝膠電泳進(jìn)行DNA分離純化

　　電泳（electrophoresis）是帶電物質(zhì)在電場(chǎng)中向著與其電荷相反的電極方向移動(dòng)的現(xiàn)象。各種生物大分子在一定pH條件下，可以解離成帶電荷的離子，在電場(chǎng)中會(huì)向相反的電極移動(dòng)。凝膠是支持電泳介質(zhì)，它具有分子篩效應(yīng)。含有電解液的凝膠在電場(chǎng)中，其中的電離子會(huì)發(fā)生移動(dòng)，移動(dòng)的速度可因電離子的大小形態(tài)及電荷量的不同而有差異。利用移動(dòng)速度差異，就可以區(qū)別各種大小不同的分子。因而，凝膠電泳可用于分離、鑒定和純化DNA的片段，是分子生物學(xué)的核心技術(shù)之一。

　　凝膠電泳技術(shù)操作簡(jiǎn)單而迅速，分辨率高，分辨范圍廣。此外，凝膠中DNA的位置可以用低濃度熒光插入染料如溴化乙錠（ethidium bromide，EB）或SYBR Gold染色直接觀察到，甚至含量少至20pg的雙鏈DNA在紫外激發(fā)下也能直接檢測(cè)到。需要的話，這些分離的DNA條帶可以從凝膠中回收，用于各種各樣目的的實(shí)驗(yàn)。

　　分子生物學(xué)中，常用的兩種凝膠為瓊脂糖（agarose）和聚丙烯酰胺凝膠。這兩種凝膠能灌制成各種形狀、大小和孔徑，也能以許多不同的構(gòu)型和方位進(jìn)行電泳。聚丙烯酰胺凝膠分辨率高，使用于較小分子核酸（5—500bp）的分離和蛋白質(zhì)電泳。它的分辨率非常高，長(zhǎng)度上相差1bp或質(zhì)量上相差0。1%的DNA都可以彼此分離，這也是采用聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行DNA序列分析的分子基礎(chǔ)。雖然它能很快地進(jìn)行電泳，并能容納較大的DNA上樣量，但是與瓊脂糖凝膠相比，在制備和操作上繁瑣。瓊脂糖是從海藻中提取的長(zhǎng)鏈狀多聚物，由β—D—吡喃半乳糖與3，6—脫水—L—吡喃半乳糖組成，相對(duì)分子質(zhì)量為104—105。瓊脂糖加熱至90℃左右，即可溶化形成清亮、透明的液體，澆在模版上冷卻后形成凝膠，其凝固點(diǎn)為40—45℃。瓊脂糖凝膠相對(duì)于聚丙烯酰胺凝膠分辨率低，但它的分離范圍更大（50至百萬(wàn)bp），小片段DNA（50—20000bp）最適合在恒定輕度和方向的電場(chǎng)中水平方向的瓊脂糖凝膠內(nèi)電泳分離。瓊脂糖凝膠電泳易于操作，適用于核酸電泳，測(cè)定DNA的相對(duì)分子質(zhì)量，分離經(jīng)限制酶水解的DNA的片段，進(jìn)一步純化DNA等。

　　瓊脂糖凝膠電泳是一種常用的方法。在溶液中，由于核酸有磷酸基而帶有負(fù)電荷，在電場(chǎng)中向正極移動(dòng)。DNA在瓊脂糖凝膠中的電泳遷移率主要取決于6個(gè)因素：樣品DNA分子的大小、DNA分子的構(gòu)象、瓊脂糖濃度、電泳所用電場(chǎng)、緩沖液和溫度。

　　三、【實(shí)驗(yàn)材料】

　　1、實(shí)驗(yàn)儀器

　　培養(yǎng)皿、接種環(huán)、三角瓶、酒精燈、恒溫振蕩培養(yǎng)箱、50ml離心管、1。5ml塑料離心管（Eppendorf管）、高速離心機(jī)、漩渦振蕩器、微量移液器、不同型號(hào)槍頭、天平、制膠槽、梳子、電泳儀、吸管、量筒、微波爐、滅菌鍋、恒溫水浴鍋、試劑瓶、衛(wèi)生紙和記號(hào)筆、手套等。

　　2、實(shí)驗(yàn)試劑

　　LB培養(yǎng)基，抗生素Ap（氨芐青霉素），溶液Ⅰ，溶液Ⅱ，溶液Ⅲ，RNaseA母液，TE緩沖液，飽和酚，氯仿/異戊醇混合液，酚/氯仿/異戊醇（PCI）混合液，預(yù)冷無水乙醇，TAE電泳緩沖液（10×），上樣緩沖液（6×），瓊脂糖，溴化乙錠（EB），DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)物DNA Marker λ/Hind Ⅲ，5mol/L pH 5。2的醋酸鈉。

　　四、【實(shí)驗(yàn)步驟】

　　1、準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)

　　配制LB液體培養(yǎng)基，分裝到100ml的三角瓶中20ml，300ml的三角瓶中50ml，另配LB固體培養(yǎng)基；準(zhǔn)備1000ul、200ul、10ul移液槍尖各一盒，1。5ml離心管若干于500ml三角瓶中，50ml離心管2個(gè) ，將上述物品包好連同配好的培養(yǎng)基一同滅菌。

　　2、菌體培養(yǎng)

　　在含有Ap的LB平板上挑取一環(huán)攜帶有質(zhì)粒pUC19的E。coli DH5單菌落，接種于20mlLB液體培養(yǎng)基中進(jìn)行37℃振蕩過夜培養(yǎng)，培養(yǎng)基中加Ap100ul

　�。�100ug/ml），質(zhì)粒pUC19具有Ap抗性基因，使得帶有pUC19的質(zhì)粒得以生長(zhǎng)。 過夜培養(yǎng)后菌體量大，雜質(zhì)較多，然后用移液槍吸取過夜培養(yǎng)物2ml轉(zhuǎn)接于50mlLB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中加入Ap250ul，37℃振蕩培養(yǎng)4—6h至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后期，生長(zhǎng)速率快，代謝旺盛，酶系活躍，雜質(zhì)少，適合提取質(zhì)粒。

　　3、質(zhì)粒提取

　�。�1）稱量空的50ml離心管的重量為14。331g，然后將三角瓶中的菌液倒至管中，不能倒?jié)M，液面距管口約1cm，7000rpm離心5分鐘后棄去上清液，收集菌體細(xì)胞。

　�。�2）向離心管中懸滴加入5ml冰預(yù)冷的溶液Ⅰ打散菌體洗滌，用漩渦振蕩器使之充分懸浮后用槍尖吹吸混勻，同步驟（1）離心，棄去上清，將離心管倒置于吸水紙上，使上清液全部流盡干燥，然后稱重得14。437g，則菌體質(zhì)量為106mg。

　　（3）洗滌后每100mg菌體應(yīng)加入冰預(yù)冷的溶液Ⅰ1ml，106mg菌體按100mg菌體處理，加入溶液Ⅰ1ml，打散菌泥、吹吸混勻，冰浴5min。溶液Ⅰ中的葡萄糖使

　　溶液密度增加，懸浮后的大腸桿菌不會(huì)快速沉積到管子的底部；維持滲透壓，防止細(xì)胞提前破裂，防止DNA受機(jī)械剪切力作用而降解。EDTA是Ca2+和Mg2+等二價(jià)金屬離子的螯合劑，可抑制DNase的活性，抑制微生物的生長(zhǎng)。Tris—Cl溶液提供適當(dāng)?shù)膒H。

　�。�4） 按比例加入新配制的溶液Ⅱ2ml（與溶液Ⅰ對(duì)應(yīng)），輕加輕搖，冰浴5min。溶液變清亮透明粘稠如蛋清狀。溶液Ⅱ中的NaOH使細(xì)胞膜發(fā)生了從bilayer（雙層膜）結(jié)構(gòu)向micelle（微囊）結(jié)構(gòu)的相變化導(dǎo)致細(xì)胞溶解。同時(shí)，強(qiáng)堿性使染色體DNA、質(zhì)粒DNA和蛋白質(zhì)變性；SDS為下一步沉淀做鋪墊。

　�。�5）按比例加入冰預(yù)冷的溶液Ⅲ1。5ml（與溶液Ⅰ、Ⅱ?qū)��?yīng)），輕加輕搖，冰浴10min。溶液出現(xiàn)白色絮狀沉淀。沉淀為蛋白質(zhì)SDS復(fù)合物、細(xì)胞碎片和其他大分子成分。溶液Ⅲ中的HAc中和NaOH，因?yàn)殚L(zhǎng)時(shí)間的堿性條件會(huì)打斷基因組DNA，只要是50－100 kb大小的片斷，就不能再被PDS共沉淀。同時(shí)變性的質(zhì)粒DNA復(fù)性。反應(yīng)形成的高鹽環(huán)境進(jìn)一步加速了沉淀。

　�。�6）12000rpm離心15min，白色沉淀聚集在離心管一側(cè)，用移液槍將上清液轉(zhuǎn)移到另一潔凈的離心管中。然后向上清液中加入1/10體積的3MNaAc混勻，加入2倍體積的冰無水乙醇，混勻，—20℃下沉降30分鐘。乙醇可以任意比和水相混溶，乙醇與核酸不會(huì)起任何化學(xué)反應(yīng)，對(duì)DNA很安全，因此是理想的沉淀劑。 DNA溶液是DNA以水合狀態(tài)穩(wěn)定存在，當(dāng)加入乙醇時(shí)，乙醇會(huì)奪去DNA周圍的水分子，使DNA失水而易于聚合。在pH為8左右的溶液中，DNA分子是帶負(fù)電荷的，加一定濃度的NaAc或NaCl，易于互相聚合而形成DNA鈉鹽沉淀。

　�。�7） 以12000rpm離心15min，小心倒去上清液，得到DNA沉淀。加入3ml70%冰乙醇，輕輕地覆蓋沉淀，不打散沉淀，洗滌一次。

　�。�8）以12000rpm離心5min，離心管底部DNA沉淀所在面應(yīng)與收集沉淀面一致。去掉上清液，將離心管上沉淀部位做好標(biāo)記，將離心管倒置于吸水紙上，干燥5min。粗提取的質(zhì)粒呈淺黃色，隨著水分的減少質(zhì)粒變?yōu)闊o色。所以為了完全溶解質(zhì)粒，要在離心管上標(biāo)記質(zhì)粒所在位置。

　�。�9）將DNA沉淀溶于1mlTE緩沖液中，移液槍吹吸助溶，然后將溶解液轉(zhuǎn)移到一個(gè)Eppendorf管中。TE是pH緩沖液，為DNA提供穩(wěn)定的生理狀態(tài)，呈弱堿性，有利于保護(hù)堿基對(duì)。同時(shí)含有EDTA是二價(jià)陽(yáng)離子的螯合劑，抑制DNA酶作用。

　　4、質(zhì)粒純化

　�。�1）Eppendorf管中加入RNase A（純濃度＞50ug/ml），37℃保溫0。5—1h

　�。�2）將上述的溶液平均分配到2個(gè)1。5ml的微量離心管中，每管0。5ml，分別加入與溶液等體積的（500ul）Tris飽和苯酚溶液，振蕩混勻，7000rpm，離心5min，上清液轉(zhuǎn)移到一潔凈的Eppendorf管中。苯酚是經(jīng)Tris飽和后的，顯黃色。苯

　　酚加入后，溶液分層，苯酚向下，下層呈淺黃色，上層溶液無色，在中間產(chǎn)生大量白色沉淀，此為變性后的蛋白質(zhì)。

　�。�3）加入等體積的（500ul）苯酚/氯仿溶液（1：1），振蕩混勻， 7000rpm，離心5min，上清液轉(zhuǎn)移到到另一潔凈的Eppendorf管中。苯酚是強(qiáng)的蛋白變性劑，但是苯酚留在質(zhì)粒溶液中會(huì)影響DNA的酶切，它本身易被氧化，會(huì)損傷質(zhì)粒。氯仿也是蛋白變性劑，但是比酚弱，且能溶解質(zhì)粒中的脂類，溶解苯酚，去除溶液中的苯酚。異戊醇則可起消除抽提過程中出現(xiàn)的泡沫，有利于分層更明顯。此時(shí)溶液中已看不到明顯的白色沉淀，但仍有蛋白質(zhì)的存在。

　�。�4）加入等體積的氯仿溶液，振蕩混勻， 7000rpm，離心5min，上清液轉(zhuǎn)移到一潔凈的Eppendorf管中，得上清液400ul。

　　（5）向上清液中加入1/10體積的NaAc混勻，再加入2倍體積的冰無水乙醇，混勻，—20℃下沉降30分鐘。

　�。�6）以12000rpm，離心15min，棄去上清液，得到DNA沉淀，為白色。

　�。�7）向DNA沉淀中加入70%冰乙醇200ul，不打散沉淀，洗滌。然后以12000rpm離心5min，離心管底部DNA沉淀所在面應(yīng)與收集沉淀面一致。

　�。�8）去掉上清液，將離心管倒置于吸水紙上，室溫干燥。用50ulTE溶解于1管中。

　　5、質(zhì)粒檢測(cè)

　　（1）稱取0。4g的瓊脂糖，置于一錐形瓶中，在三角瓶上標(biāo)好液面位置，加入40ml的1×TAE電泳緩沖液，再加入5—10ml重蒸水，以補(bǔ)充在溶膠過程中損失的水分。然后置微波爐加熱至完全溶化，溶液透明。冷卻至50℃左右，倒入制板槽制板。

　�。�2）待膠凝固后，小心拔起梳子，使加樣孔端置陰極段放進(jìn)電泳槽內(nèi)。在槽內(nèi)加入1×TAE 電泳緩沖液，至液面覆蓋過膠面2—3cm。取1μl加電泳載樣液和3μl質(zhì)粒樣品于小紙片上，用移液槍混勻。

　�。�3）電泳1h，觀察溴酚蘭的帶（藍(lán)色）的移動(dòng)。

　　（4） 把膠槽取出，小心滑出膠塊，放進(jìn)EB溶液中進(jìn)行染色，完全浸泡約5min。

　�。�5）凝膠成像儀觀察。

　　五、【注意事項(xiàng)】

　�。�1）滴加溶液II時(shí)，要逐滴加入，且要輕加輕搖溶液使之混勻，整體動(dòng)作要快，因?yàn)閺?qiáng)堿在溶液中停留時(shí)間不能過長(zhǎng)，否則會(huì)破壞質(zhì)粒DNA。

　�。�2）加入溶液III后，生成了大量的絮狀沉淀，溶液III中和強(qiáng)堿使質(zhì)粒復(fù)性，不可劇烈震蕩， 防止染色體DNA斷裂，應(yīng)該上下顛倒離心管，使其混勻。

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