紫心甘薯多糖的分離及組分抑癌活性研究的論文
天然活性多糖是一類結(jié)構(gòu)復(fù)雜的生物大分子物質(zhì)，作為植物細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)成分廣泛存在于自然界中，具有機(jī)體免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、降血糖血脂等作用近年來(lái)，多糖研究日益受到人們的關(guān)注。目前，實(shí)驗(yàn)室常用熱水浸提和低溫堿提兩種方法來(lái)獲得天然活性多糖，如香菇多糖,海藻多糖等M。已有研究表明，采用熱水浸提所得的天然植物多糖（如人參多糖）經(jīng)純化在體內(nèi)外均具有一定的抗腫瘤活性0,也有報(bào)道紫心甘薯水提粗多糖在體內(nèi)有一定的抑瘤效果,但尚未見到關(guān)于紫心甘薯多糖分離及組分抑癌研究的相關(guān)報(bào)道。本研究結(jié)合浙江省臨安市太陽(yáng)鎮(zhèn)紫心甘薯基地的開發(fā)課題，以紫心甘薯“渝紫263”為材料,通過(guò)低溫堿提獲得紫心甘薯粗多糖,研究紫心甘薯多糖組分的分離條件,并借助體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和紅外光譜等檢測(cè)手段初步探究紫心甘薯多糖的結(jié)構(gòu)成分及組分的抑癌作用，為進(jìn)一步開發(fā)和利用紫心甘薯提供理論指導(dǎo)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
1材料與方法
1.1材料
1.1.1實(shí)驗(yàn)材料與試劑紫心甘薯，由浙江省臨安市太陽(yáng)鎮(zhèn)紫心甘薯實(shí)驗(yàn)基地提供;腫瘤細(xì)胞株Hela、HepG:,由浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院提供；DEAE-Cellulose,華東醫(yī)藥試劑；CM-Cellulose,華東醫(yī)藥試劑；SephacrylS-t00,美國(guó)GE公司;D-葡萄糖醛酸，國(guó)藥集團(tuán)試劑；咔唑，中國(guó)遠(yuǎn)航試劑;胎牛血清,杭州四季青生物工程材料有限公司；RPMI1640培養(yǎng)基，Hyclone公司；MTT,Sigma公司（臨用時(shí)用PBS配置成5mg/ml溶液，分裝避光-20°C保存）；DMSO,Sigma公司；
標(biāo)準(zhǔn)單糖（葡萄糖、果糖、半乳糖、木糖）、NaCl、苯酚、濃硫酸、甲苯胺藍(lán)等試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。
1.1.2主要儀器AKTAprimeplus層析系統(tǒng)，美國(guó)GE公司；LDR44.4C低速冷凍離心機(jī)，北京醫(yī)用離心機(jī)廠；高速冷凍離心機(jī),BECKMANCOULTER；可見分光光度計(jì)，上海棱光技術(shù)有限公司；RE-2000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,上海亞榮生化儀器廠；電子天平，德國(guó)IKA;磁力攪拌器，IKARHbasicl;紅外光譜儀470FT-IR,NEXUS公司；倒置顯微鏡，OLYMPUS；二氧化碳培養(yǎng)箱，美國(guó)FormaScientific公司；516MC酶標(biāo)儀，國(guó)產(chǎn);各種尺寸層析柱，上海華美實(shí)驗(yàn)儀器廠;薄層層析硅膠板,浙江臺(tái)州；真空干燥裝置,上海一恒科技有限公司；層析缸，國(guó)產(chǎn)。
1.2方法
1.2.1紫心甘薯多糖提取參見文獻(xiàn)0。甘薯洗凈、去皮、烘干后粉碎；用3倍體積95%乙醇于80C水浴中回流脫脂2h,重復(fù)一次，晾干后在70C水浴中水提2h,離心分離上清液,殘?jiān)貜?fù)操作一次;合并上清液，濃縮,三氯乙酸法除蛋白，用3倍體積85%乙醇沉淀多糖；無(wú)水乙醇、丙酮反復(fù)洗滌；將沉淀在低溫下用10%NaOH以1:10的比例進(jìn)行堿提，濃縮，蒸餾水透析48h;用3倍體積85%乙醇沉淀多糖；離心取沉淀，用無(wú)水乙醇反復(fù)洗滌；真空烘干后得PPSP粗多糖。
1.2.2多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制苯酚4硫酸法檢測(cè)糖含量，以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)單糖,繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線;硫酸咔唑法檢測(cè)糖醛酸含量，以葡萄糖醛酸為標(biāo)準(zhǔn)品,繪制糖醛酸含量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線。1.2.3離子交換層析參見文獻(xiàn)_。離子交換柱的選擇：配置0.05mol/LPBS緩沖液（K2HPO4-CH2PO4),再用此緩沖液配置0.5mol/LNaCl溶液,用0.45^m纖維素微孔濾膜過(guò)濾，超聲脫氣30min。將處理好的DEAE~Cellulose和CM-Cellulose分別裝柱（2.6X30cm),用3倍柱體積的緩沖液平衡。取PPSP粗多糖，用去離子水配置成5mg/ml的PPSP多糖溶液,分別上樣10ml,待吸附30min后，用相同體積的去離子水分別洗脫,流速1ml/min,每管10ml收集,苯酚^硫酸法檢測(cè),記錄并作洗脫曲線。
洗脫液pH的選擇：選用上述吸附效果較好的柱子，取50mgPPSP粗多糖3份,分別溶于10ml的pH7.2、H7.6、H8.1和pH8.6的PBS緩沖液中，經(jīng)0.45^m濾膜過(guò)濾，緩慢上樣，吸附30min后，用200ml對(duì)應(yīng)pH緩沖液洗脫，流速1.0ml/min,每管10ml,苯酚~硫酸法檢測(cè)，記錄并作洗脫曲線。
洗脫方式的選擇：確定交換柱與pH緩沖體系之后，探究不同洗脫方式對(duì)PPSP洗脫效果的`影響。取5mg/ml多糖溶液10ml,濾膜過(guò)濾,緩慢上樣，吸附30min。先后分別用蒸餾水、0.05mol/LpH7.6的PBS緩沖液結(jié)合0.1、.3、.5mol/LNaCl分段洗脫。流速1.0ml/min,每管10ml,分別收集。苯酚~硫酸法測(cè)定,作洗脫曲線，合并主要峰，透析除鹽，濃縮，冷凍烘干待用。
1.2.4多糖收集和檢測(cè)利用美國(guó)GE公司蛋白純化儀自動(dòng)收集器收集離子交換層析的洗脫液,采用苯酚4硫酸法跟蹤檢測(cè)各PPSP多糖組分（od490),以管號(hào)為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制洗脫曲線，收集同種多糖組分。雙蒸水透析48h,每12h換一次水,磁力攪拌。透析完畢,冷凍干燥得各多糖組分。
1.2.5凝膠過(guò)濾層析將處理好的SephcrylS400裝柱（屮2.6X30cm),用0.05mol/L的NaCl平衡,流速0.5ml/min。上述分離得到的樣品溶于0.05mol/L的NaCl溶液中，濾膜過(guò)濾后取5ml緩慢上樣，用0.05mol/L的NaCl溶液150ml洗脫，流速0.5ml/min,每管5ml分部收集,苯酚4硫酸法檢測(cè),作洗脫曲線圖。
1.2.6薄層層析樣品處理:取紫心甘薯多糖樣品，按多糖：硫酸=4:1的比例加入6mol/L的％SO4,密封90C水解6h,碳酸鋇中和，離心去沉淀。取葡萄糖、糖醛酸、果糖、半乳糖、甘露糖、山梨糖等標(biāo)準(zhǔn)單糖做同樣處理。待硅膠板活化后，用毛細(xì)管進(jìn)行點(diǎn)樣。展層劑:正丁醇：乙酸乙酯：異丙醇：乙酸:水=7:20:12:7:5;顯色劑:苯胺4卩苯二甲酸。
1.2.7紅外光譜鑒定取約1mg已純化的PPSP多糖組分樣品，與適量KBr粉末在白熾燈下干燥磨混均勻，壓片機(jī)壓片，采用傅里葉變換紅外光譜儀在4000cm-1~400cm-1區(qū)間掃描。
1.2.8MTT法檢測(cè)PPSP多糖組分對(duì)Hela和HepG2腫瘤細(xì)胞的體外抑制作用參見文獻(xiàn)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Hela和HepG細(xì)胞，分別用胰蛋白酶消化后接種于96孔板中。設(shè)置不同PPSP多糖組分濃度的實(shí)驗(yàn)組，將標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖和PPSPI、PPSPn、PPSPM三種多糖組分臨用前用PBS配置成終濃度為10、20、40、80^g/ml溶液,紫外滅菌。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組的各濃度梯度組,每孔加上述多糖組分溶液20空白對(duì)照組加入相同體積的PBS,每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔，置于37C,5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。在加樣后第24、8、96h時(shí)各取一塊96孔板，加入20^lMTT溶液繼續(xù)培養(yǎng)4h。小心吸盡培養(yǎng)液，加入200^lDMSO,震蕩,使藍(lán)紫色結(jié)晶物充分溶解,于490nm波長(zhǎng)下測(cè)各孔吸光度。腫瘤細(xì)胞抑制率公式:抑制率IR(%)=(1-A實(shí)驗(yàn)組/A空白對(duì)照組）x100%。
1.3數(shù)據(jù)處理采用SPSS18.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)取三次平均值,采用方差分析（F檢驗(yàn)）,有顯著差異時(shí)，再作共同對(duì)照t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2結(jié)果與分析
2.1多糖提取及標(biāo)準(zhǔn)曲線經(jīng)堿提法獲得紫心甘薯粗多糖,經(jīng)計(jì)算其得率為31.72%;檢測(cè)到樣品中糖含量為55.4pg/ml,糖醛酸含量為
11.51^g/ml；實(shí)驗(yàn)得出葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線為：A=0.5C-0.005(R=0.9986),糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)曲線為：A=0.0053C(R2=0.9991)。
2.2離子交換層析
不同類型弱離子交換柱選擇在一定條件下，分別經(jīng)DEAE-Cellulose弱陰離子交換柱和CM-Cellulose弱陽(yáng)離子柱父換洗脫，洗脫圖見圖1。圖1(a)的洗脫峰基本對(duì)稱,峰形較規(guī)則;相比之下，圖1(b)的洗脫峰較寬，無(wú)對(duì)稱性且分布不均勻。推測(cè)DEAE-Cellulose柱對(duì)PPSP多糖的選擇吸附性要比CM-Cellulose柱好，因此本實(shí)驗(yàn)選用DEAE-Cellulose柱分離PPSP多糖。2.2不同pH緩沖液選擇PPSP多糖經(jīng)不同pH值的PBS緩沖液洗脫得洗脫圖，見圖2。多糖是一類多羥基聚合物，中性或酸性多糖容易在堿性條件下被弱陰離子交換柱吸附。從圖
2(a)分析可知,pH7.2的緩沖液洗脫時(shí)并沒有出現(xiàn)對(duì)稱峰形,繼續(xù)洗脫得到拖尾峰。圖2(b)顯示,pH7.6的緩沖液在洗脫體積為100ml時(shí)開始出峰,且峰形對(duì)稱、均一、含量較大。結(jié)合圖2(c)和圖2(d)分析,洗脫液堿性條件(pH大于8.2)對(duì)PPSP多糖分離不利，因此PPSP多糖分離的最佳洗脫緩沖液pH值為7.6。
2.2.3洗脫方式優(yōu)化在pH7.6的條件下,將PBS緩沖液結(jié)合NaCl溶液進(jìn)行0~1mol/ml濃度范圍的線性洗脫（圖3)。可以看出，第一個(gè)PPSP多糖組分分離完全,但繼續(xù)洗脫后并沒有將剩余多糖組分很好地分離。推測(cè)線性洗脫時(shí)低鹽濃度對(duì)PPSP的分離有效，高濃度鹽溶液不適用于該多糖的分離。
與線性梯度洗脫相比較，分段洗脫更適用于不同多糖組分間的分離，峰形陡而尖且相對(duì)
完整,見圖3。收集四個(gè)多糖組分吸收峰，分別命名為ppspI、ppspn、ppspm和ppspw。前三個(gè)多糖組分的含量相對(duì)較高，經(jīng)過(guò)SephcrylS-400凝膠柱后得到了單一對(duì)稱峰,純度較好。
根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)選用以下條件來(lái)進(jìn)行PPSP多糖的離子交換色譜分離：弱陰離子交換柱DEAE-Cellulose；在pH7.6的0.05mol/LPBS緩沖液（I(2HPO44CH2PO4)體系下,采用200mlPBS緩沖液、200ml0.1mol/LNaCl溶液、300ml0.3mol/LNaCl溶液和100ml0.5mol/LNaCl溶液進(jìn)行分段洗脫。
1.3薄層層析結(jié)果完全酸水解的紫心甘薯多糖PPSPI、PPSPH、PPSP1,二次層析結(jié)果分析多糖組分的單糖組成為:PPSPI主要由葡萄糖和半乳糖組成，ppspn主要由葡萄糖組成;ppspm沒有檢測(cè)到結(jié)果，分析可能與其糖蛋白成分干擾有關(guān)。
2.4紅外光譜結(jié)構(gòu)分析ppsph的紅外光譜圖（圖4):881cm-1的峰表明PPSPH中的糖苷鍵為P型（a型糖苷鍵的吸收峰在890cm-1左
右處）。1097cm-1和1041cm-1的吸收峰表在1384~1076cm-1具有明顯特征吸收峰），示PPSPH中的糖環(huán)構(gòu)型為吡喃型（呋喃型糖環(huán)表明PPSPH具有P~D-葡萄吡喃聚糖的特征吸收峰。
PPSP1的紅外光譜圖（圖5)：在3422cm-1附近有O-H伸縮振動(dòng)的強(qiáng)吸收峰，1630cm-1可能是~CHO中C=O的伸縮振動(dòng),這兩組峰是多糖的特征吸收峰;1100cm-1可能是C4的彎曲振動(dòng)峰,另外,在1425cm-1具有較弱的吸收峰，為蛋白質(zhì)特征吸收峰。因此，推測(cè)ppspm可能為糖蛋白。
1.5多糖組分對(duì)腫瘤細(xì)胞株Hela和HepG:的體外抑制作用PPSPn組分對(duì)Hela和HepG2腫瘤細(xì)胞株的體外抑制效果如圖6所示,PPSPH對(duì)Hela和HepG:細(xì)胞在體外具有一定的抑制作用，并呈劑量依賴效應(yīng)。從圖6(a)中可看出，10ag/ml劑量組在48h時(shí)達(dá)到最大,然后
開始下降,20ag/ml和40ag/ml劑量組在24h時(shí)達(dá)到最大,80ag/ml劑量組受到強(qiáng)烈抑制,細(xì)胞數(shù)量一直下降。從圖6(b)圖中可以看出,PPSPn組分
41.83%,61.45%,68.67%(P<0.01)。圖6(c)中顯示，不同濃度的ppspn組分作用下,20ag/ml,40ag/ml,80ag/ml劑量組均在48h時(shí)細(xì)胞活力達(dá)到最大，然后開始下降。從圖6(d)中可看出，PPSPH組分對(duì)HepG2細(xì)胞株在96h時(shí)均有較高的抑制率,分別為30.76%,36.83%,42.46%,48.53%(P<0.01)。
PPSP1組分對(duì)Hela和HepG2腫瘤細(xì)胞株的體外抑制效果如圖7所示,PPSP1對(duì)Hela和HepG2細(xì)胞在體外具有一定的抑制作用，并呈劑量依賴效應(yīng)。從圖7(a)中可看出,20ag/ml和40ag/ml劑
量組在48h時(shí)細(xì)胞活力達(dá)到最大,80ag/ml劑量組在24h時(shí)細(xì)胞活力達(dá)到最大,然后開始下降。從圖7(b)中可以看出,40ag/ml劑量組在48h和96h的抑制率分別為34.50%和42.07%(P<0.05),80ag/ml劑量組在48h和96h時(shí)的抑制率分別為42.81%(P<0.05)和54.13%(P<0.01)。從圖7(c)中顯示，20ag/ml'40ag/ml'80ag/ml劑量組均在48h時(shí)細(xì)胞活力達(dá)到最大,然后開始下降。從圖7(d)中可得,40ag/ml劑量組在96h時(shí)抑制率為54.68%(P<0.05),80ag/ml劑量組在24h、48h和96h時(shí)抑制率分別為33.15%(P<0.05),41.86%(P<0.05)和71.08%(P<0.01)。
同時(shí),本實(shí)驗(yàn)在設(shè)計(jì)了PBS溶液作為空白對(duì)照組以外，還選取標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液作為實(shí)驗(yàn)參考。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn):加入標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液后，Hela和HepGi腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)趨勢(shì)與空白對(duì)照組相似,且相應(yīng)同濃度的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖對(duì)兩種腫瘤細(xì)胞的抑制不明顯，不存在劑量依賴效應(yīng)。
3討論
本實(shí)驗(yàn)以浙江省臨安市太陽(yáng)鎮(zhèn)紫心甘薯“渝紫263”為研究對(duì)象,低溫堿提法獲得紫心甘薯多糖，在比較了ppsp多糖的弱陽(yáng)離子和弱陰離子交換柱的洗脫分離效果后，選用DEAE-Cellulose弱陰離子交換柱進(jìn)行分離，獲得了4個(gè)多糖組分（PPSPI、PPSPn、PPSPM和PPSP^)。據(jù)國(guó)外研究報(bào)道13,中性多糖和酸性多糖常通過(guò)弱陰離子交換柱進(jìn)行分離,低鹽濃度下洗脫得到中性多糖，而高鹽濃度下洗脫的多為酸性多糖；中性多糖可以進(jìn)一步經(jīng)凝膠過(guò)濾層析被分離成a-葡聚糖（吸附較強(qiáng)）和p肩聚糖（吸附較弱）。本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),ppspI在低鹽濃度下最先被洗脫出來(lái)，且經(jīng)檢測(cè)不含糖醛酸,推測(cè)PPSPI為中性多糖組分,PPSPH、PPSPM和PPSPW隨后被洗脫分離，推測(cè)為酸性多糖。紫心甘薯多糖組分的體外抑癌實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，酸性多糖PPSPH和PPSPM在體外對(duì)Hela和HepGi腫瘤細(xì)胞株生長(zhǎng)有一定的抑制作用，而中性多糖PPSPI無(wú)明顯的抑制效果。以上結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道的天然活性多糖中酸性多糖對(duì)癌細(xì)胞生長(zhǎng)有較明顯抑制效果的觀點(diǎn)相符M。
多糖組分的結(jié)構(gòu)與其生物活性之間的關(guān)系一直是研宄的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。天然活性多糖中含有豐富的中性多糖和酸性多糖，單糖間以糖苷鍵相連,有些單糖與蛋白質(zhì)或脂質(zhì)相連,構(gòu)成糖蛋白或糖脂，這些不同的連接方式賦予了天然活性多糖抗腫瘤活性的良好結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)&443。本實(shí)驗(yàn)從PPSP多糖對(duì)腫瘤細(xì)胞體外抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果中初步表明“渝紫263”中所含的天然活性多糖中的PPSPH和PPSPM組分具有一定的體外抑癌活性，分析可能與它所含有的P~D-葡萄吡喃聚糖和糖蛋白成分有關(guān)。目前PPSPH、PPSPM組分的構(gòu)效分析仍在深入研究中。
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