黃芩有效成分在炎癥通路中的作用靶點研究進度論文
炎癥反應(yīng)作為一種基本病理過程與許多常見炎癥性疾病有著密切的聯(lián)系，并且隨著現(xiàn)代研究的不斷深入，越來越多影響人類健康的疾病如高血壓、糖尿病、癌癥等也逐漸被發(fā)現(xiàn)與炎癥反應(yīng)有著密切的聯(lián)系。中藥黃芩來源于唇性科黃芩屬植物黃芩Scutellaria baicalensis 的干燥根，是一種十分常見的中藥材，在我國有著悠久的使用歷史，它始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，性味苦寒，有清熱燥濕之功效，主要用于濕熱證，證見發(fā)熱胸痞、食欲不振、小便短少、舌苔黃膩等。黃芩的化學(xué)成分有黃酮類、酚酸類、苯乙醇、氨基酸、甾醇、精油、微量元素等。其活性成分主要為黃酮類化合物，包括黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷、漢黃芩素、新黃芩素等，研究表明它們都具有一定的抗炎作用，能夠減少腫瘤壞死因子-α( TNF-α) ，白細胞介素-1β( IL-1β) 等重要炎癥介質(zhì)的釋放并且抑制細胞毒性分子一氧化氮( NO) 的產(chǎn)生，從而對機體產(chǎn)生保護作用。近年來通過對黃芩抗炎作用的不斷研究，黃芩有效成分的抗炎作用機制也逐漸被人們所掌握，其中就包括對炎癥通路的阻斷作用，黃芩中多種有效成分能夠作用于炎癥通路中的關(guān)鍵靶蛋白影響其活性從而抑制炎癥反應(yīng)的發(fā)生，但在眾多研究中，研究者往往僅從單個蛋白或者單條通路探討黃芩有效成分對其中的影響，缺乏一定的整體性。本文從黃芩有效成分在炎癥通路中的作用為出發(fā)點，就黃芩有效成分在整個炎癥通路中作用的靶蛋白做一個較為全面的總結(jié)，為黃芩抗炎作用的進一步研究與應(yīng)用提供參考。
1 對TLR 通路的影響
Toll 樣受體蛋白( Toll-like receptors，TLR) 最初是在果蠅體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的一種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，在果蠅的發(fā)育和免疫反應(yīng)中有重要的作用。隨著研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)在哺乳動物體內(nèi)也同樣存在著Toll 樣受體蛋白，并將這種蛋白統(tǒng)一歸為TLR 家族。它們能夠結(jié)合一些病原體或其產(chǎn)物共有的特定分子結(jié)構(gòu)來進行識別，還可以對不同病原體的相關(guān)分子結(jié)構(gòu)進行識別繼而引發(fā)一系列的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而導(dǎo)致炎癥介質(zhì)的釋放，并最終激活獲得性免疫反應(yīng)�，F(xiàn)代研究表明中藥黃芩的有效成分能夠作用于TLR 通路的多個靶蛋白，從而抑制炎癥反應(yīng)，減少炎癥介質(zhì)的釋放。
1. 1 對TLR2 和TLR4 蛋白的抑制作用作為TLR
家族的一員，TLR2 和TLR4 的激活可誘導(dǎo)很強的免疫反應(yīng)，在炎癥正反應(yīng)中起著重要的作用，是天然免疫反應(yīng)和獲得性免疫反應(yīng)之間的關(guān)鍵鏈接因子。多項研究表明黃芩苷能夠抑制多種炎癥疾病引起的老鼠體內(nèi)TLR2 和TLR4 蛋白表達升高，并抑制其相關(guān)基因的表達。Hou 等在對細胞研究中還證實黃芩苷還能夠減少缺氧引起的大鼠小膠質(zhì)細胞中TLR4 mRNA 表達上升進而減少TNF-α， IL-1β， IL-6等炎癥因子的釋放。另據(jù)報道黃芩的另一成分漢黃芩苷也同樣被證實能抑制致炎因子LPS 導(dǎo)致的TLR4 蛋白的異常表達。這些均表明TLR 蛋白可能為黃芩抑制炎癥反應(yīng)的作用靶點。
1. 2 對MYD88， IRAK，TAK 蛋白的抑制作用
髓樣化因子88( MyD88) 是MyD88 依賴性TLR 信號通路中的一個主要接頭蛋白，C 端為TIR 結(jié)構(gòu)域，可與白介素-1 受體相關(guān)激酶( interleukin-1 receptorassociatedkinase，IRAK) 和白介素-8 受體( IL-8receptor，IL-8R) 的TIR 結(jié)構(gòu)結(jié)合，N 端是死亡結(jié)構(gòu)( DD) 負責(zé)招募下游具有死亡結(jié)構(gòu)的信號分子。在TLR 識別相應(yīng)配體后，MyD88 與TLRs 互相作用，此時MyD88 的C 端TIR 結(jié)構(gòu)與受體結(jié)合，N 端的DD結(jié)構(gòu)招募IRAK-1， IRAK-4 和腫瘤壞死因子受體相關(guān)蛋白6 ( tumor necrosis factor receptor-associatedfactor 6，TRAF6) 到受體上，使IRAK-1，TRAF-6 活化進而發(fā)生磷酸化，而后與MyD88 解離。在TRAF-6和Ubc13 /Uevl A 的共同催化下TRAF6 自身發(fā)生泛素化，泛素化的TRAF6 通過轉(zhuǎn)化生長因子β 激活激酶( TGF-activated kinase，TAK) 的介導(dǎo)下激活下游的相關(guān)信號通路調(diào)控IL-1， IL-6 和TNF-α 等相關(guān)炎癥因子的轉(zhuǎn)錄。Lin 等通過對腎臟缺血模型Wistar 大鼠給予100，10，1mg·kg - 13 種不同劑量黃芩苷，然后使用蛋白質(zhì)免疫印跡( Western bolt) 技術(shù)對大鼠腎臟中MyD88 蛋白分子進行檢測，結(jié)果顯示3 種劑量的黃芩苷組對比模型組大鼠體內(nèi)MyD88蛋白表達量有不同程度的下降，由此證明黃芩苷能夠抑制MyD88 蛋白的表達。與此同時研究人員在對脂多糖( LPS) 致炎的研究過程中進一步發(fā)現(xiàn)黃芩苷還能夠抑制LPS 導(dǎo)致的細胞中IRAK1，TAK1 蛋白的表達上升。黃芩也因此可能以MyD88，IRAK，TAK 蛋白作為靶蛋白，阻斷炎癥通路，從而減少炎癥因子的釋放。
2 對促分裂素原活化蛋白激酶( mitogen-activatedprotein kinases，MAPK)
通路的影響MAPK 通路是炎癥調(diào)控中的一個重要信號通路。這條通路由三類蛋白激酶組成，包括MAP 激酶，MAPK 激酶以及MEK 激酶，通過這三類蛋白的依次磷酸化信號就從上游傳遞至下游的應(yīng)答分子產(chǎn)生相應(yīng)的應(yīng)答反應(yīng)。通過現(xiàn)代研究，筆者又在哺乳動物的體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶( extracellular regulated protein kinases，ERK) ，c-junN 端激酶( c-jun N-terminal kinase， JNK) ，P38MAPK等五種不同的MAPK 信號通路，它們參與應(yīng)激刺激、細菌產(chǎn)物、炎癥介質(zhì)等引起的細胞反應(yīng)，因此MAPK 的激活與炎癥反也有著密切關(guān)系。
2. 1 對Raf，MEK1 /2 以及ERK1 /2 蛋白的抑制作用
Raf 是ERK 通路中一個相對分子質(zhì)量為40 ～75 kD 的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，為一種MEK 激酶。當(dāng)細胞外刺激與相應(yīng)受體結(jié)合后Ras 活化，活化的Ras 作為銜接蛋白與Raf 結(jié)合，將Raf 由原來的細胞質(zhì)中轉(zhuǎn)移到細胞膜上。Raf 被Raf 激酶激活然后與MAPK 激酶MEK 蛋白結(jié)合，從而使MEK 激活，而MEK 的激活又能夠活化ERK 進而影響相關(guān)蛋白的轉(zhuǎn)錄表達。有明確報道顯示中藥黃芩中的有效成分黃芩素能夠抑制c6 大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞中Raf-1 蛋白和MEK-1 蛋白的磷酸化表達升高，提示了黃芩以Raf-1 蛋白和MEK-1 蛋白作為靶點作用于炎癥通路的可能。在有關(guān)人類HCC 細胞系mhcc97h 癌細胞的實驗中Chen 等證實，不同濃度的`黃芩素均能夠抑制癌癥細胞中ERK1 /2 的磷酸化上升。為黃芩通過ERK1 /2 為靶蛋白作用于炎癥反應(yīng)又提供了新的依據(jù)。
2. 2 對c-Jun 氨基末端激酶( c-Jun N-terminalkinase，JNK)
蛋白的抑制作用JNK 作為MAPKs 家族中的一員同樣能夠被環(huán)境中的各種應(yīng)激因素所激活。激活的JNK 可調(diào)控許多基因的半衰期，從而增強這些基因mRNA 的翻譯過程，從而對蛋白的表達進行調(diào)控。Luo 等的研究還表明，在使用LPS 刺激人類口腔黏膜角朊細胞( Hoks) 后細胞中JNK 蛋白的磷酸化明顯上升，然而使用黃芩苷對細胞進行與處理后LPS 引起的細胞中各個時間段上的JNK蛋白磷酸化上升得到了很好的抑制，并通過ELISA技術(shù)檢測分析進一步發(fā)現(xiàn)相關(guān)炎癥因子IL-6， IL-8等表達量對比未給藥組明顯減少。證實了JNK 為中藥黃芩在炎癥通路上的作用靶點的可能性。在此基礎(chǔ)上研究者通過初級星行角質(zhì)細胞，RAW264. 7小鼠巨噬細胞的細胞試驗以及癲癇大鼠黃芩的體外實驗中進一步證明了此結(jié)論。
2. 3 對p38 蛋白的抑制作用
p38MAPK 是MAPK家族控制炎癥反應(yīng)的重要成員，它可以受各種應(yīng)激刺激而被激活。當(dāng)p38 被激活后會發(fā)生核轉(zhuǎn)位進而使多種蛋白激酶和轉(zhuǎn)錄因子磷酸化和激活，因此筆者可以通過抑制p38 蛋白的表達與磷酸化，來對炎癥反應(yīng)進行抑制。在人類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細胞( RAFLs) 細胞中，細胞因受到應(yīng)急刺激p38蛋白被激活，其磷酸化水平因此發(fā)生升高。Chen等采用黃芩素干預(yù)培養(yǎng)人類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細胞( RAFLs) 后，通過Western blot 檢測技術(shù)對p38 蛋白磷酸化變化進行檢測。結(jié)果證明黃芩素能夠有效的減少p38 磷酸化表達上升，從而阻斷炎癥通路減少炎癥因子IL-1β 的釋放，抑制炎癥反應(yīng)的發(fā)生。并且這種抑制作用在體外動物實驗方面也表現(xiàn)出了相同的趨勢。Mao 等對癲癇大鼠連續(xù)給予黃芩素后對大鼠體內(nèi)p38 磷酸化蛋白進行檢測，結(jié)果顯示，黃芩素給藥組對比模型組大鼠體內(nèi)p38 磷酸化水平出現(xiàn)降低。并且中藥黃芩的另一種重要成分漢黃芩素對p38 磷酸化的抑制作用也被研究者發(fā)現(xiàn)證實。
3 對核因子-κB( NF-κB) 通路的影響
NF-κB 蛋白家族是近年來轉(zhuǎn)錄因子家族中的新成員，是細胞內(nèi)重要的核轉(zhuǎn)錄因子，它幾乎存在與所有類型的動物細胞中并能夠參與細胞的各種應(yīng)急刺激，包括炎癥性刺激。在之后研究中筆者又進一步發(fā)現(xiàn)了p50，p52，p65，c-Rel 等其他NF-κB 家族成員。NF-κB 蛋白家族成員之間能夠形成多種形式的二聚體。在非活狀態(tài)下NF-κB 與IKB 三聚體( IKKα， IKKβ， IKKγ 結(jié)合的穩(wěn)定三聚體) 或前體蛋白聚合的二聚體存在與細胞漿中，當(dāng)收到多種因素的刺激后IKB 三聚體降解，使NF-κB 上的核定位信號暴露，NF-κB 發(fā)生轉(zhuǎn)核。與調(diào)控基因啟動子上的KB 位點結(jié)合后啟動基因轉(zhuǎn)錄。研究人員通過使用LPS 刺激雄性ICR 小鼠后發(fā)現(xiàn)小鼠體內(nèi)p50 的表達得到上調(diào)，而后對疾病小鼠給與10 mg·kg - 1·d - 1黃芩苷進行治療，3d 后通過對比發(fā)現(xiàn)p50 的上調(diào)表達對比未給藥組表現(xiàn)出明顯的降低趨勢。于此同時Chen 等也通過實驗發(fā)現(xiàn)黃芩中的另一成分黃芩素還能夠降低人類直腸癌細胞HCT116 中p50 蛋白的表達上升。與p50 結(jié)合形成二聚體的另一種蛋白p65 則有大量的文獻報道指出，黃芩中的多種成分不僅僅能夠能夠影響p65 的蛋白表達，并且對其磷酸化、入核都有著重要的影響作用。從中也顯示出黃芩有效成分通過影響NF-κB 蛋白二聚體來抑制炎癥反應(yīng)的一個重要線索。與NF-κB蛋白二聚體結(jié)合的IKB 三聚體( IKKα， IKKβ， IKKγ結(jié)合的穩(wěn)定三聚體) 對于炎癥信號的傳遞也同樣有著重要的作用，研究者通過進一步的實驗發(fā)現(xiàn)中藥黃芩中的黃芩素、黃芩苷、漢黃芩素，對炎癥通路中IKKα， IKKβ 的磷酸化都有著良好的抑制作用。因此筆者猜測黃芩中的多種有效成分可以以NF-κB通路中的多個蛋白為靶點抑制炎癥信號的傳遞，減少炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，從而緩解炎癥反應(yīng)。
4 對酪氨酸激酶( janus kinase，JAK)
轉(zhuǎn)錄因子( STAT) 通路的影響JAK-STAT 信號通路是一條受細胞因子刺激而發(fā)生傳導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一。它能夠參與細胞的很多重要的生物學(xué)過程，例如細胞的增殖、炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)等。與其他信號通路相比， JAK-STAT 信號通路的傳遞過程相對比較簡單。主要有3 個主要的過程成，首先當(dāng)相應(yīng)受體與細胞因子結(jié)合后受體分子發(fā)生二聚化，然后與受體偶聯(lián)的JAK 相互接近并通過交互的酪氨酸磷酸化作用而發(fā)生活化使JAK激活，最后，激酶JAK 催化結(jié)合在受體上的STAT 蛋白發(fā)生磷酸化修飾，活化的STAT 蛋白以二聚體的形式進入細胞核內(nèi)與靶基因結(jié)合，調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄。Qi 等人在有關(guān)LPS 刺激RAW264. 7 小鼠巨噬細胞的實驗中證實，使用20，40，50 μmol·L - 1黃芩素處理培養(yǎng)細胞24 h 后，細胞對于LPS 引起的JAK1 /2 磷酸化上升與STST1 /3 磷酸化上升都有著抵抗作用。從中表現(xiàn)出黃芩素以JAK 蛋白與STTA蛋白為靶點的一些線索。
5 結(jié)語與展望
黃芩作為傳統(tǒng)中藥材其有效成分黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷、漢黃芩素、都已被證實具有抗炎作用，并且隨著對黃芩有效成分抗炎作用研究的不斷深入，黃芩在炎癥通路中的作用也逐漸被人們所關(guān)注，對其作用靶蛋白的描述也逐漸增多，但對于作用于靶蛋白的機制以及作用于靶蛋白強弱的研究仍然甚少，并且研究僅停留在對單個靶蛋白或者單條通路的研究上，缺乏對整個炎癥通路作用的研究總結(jié)以及比較，但這一部分對于進一步闡明中藥黃芩抗炎作用機理有著關(guān)鍵的作用，研究者仍需進一步努力，對黃芩抗炎的作用機理進一步挖掘，為黃芩現(xiàn)代化研究以及新藥研發(fā)提供依據(jù)。
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