開口箭活性部位抗腫瘤細(xì)胞作用研究論文
1 材料與儀器
1.1 細(xì)胞株人宮頸癌細(xì)胞（Hela）、人肝癌細(xì)胞（HepG2）均由三峽大學(xué)分子生物學(xué)研究所提供。
1.2 藥品與儀器RPMI-1640為美國GIBCO公司產(chǎn)品；新生小牛血清為杭州四季青生物材料有限公司產(chǎn)品；HEPES為美國Sigma公司產(chǎn)品；胰蛋白酶為美國GIBCO公司產(chǎn)品；四氮唑藍(lán)（MTT）為美國AMRESCO公司產(chǎn)品；環(huán)磷酰胺 （CP,江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號：07020121）。酶聯(lián)免疫檢測儀（GENIOS TECAN）；CO2培養(yǎng)箱（日本三洋公司）；LD4-2A離心機（北京醫(yī)用離心機廠）；96孔板（美國Cornning公司）。開口箭根莖于2002-07采自湖北省神農(nóng)架林區(qū)，經(jīng)三峽大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院陳發(fā)菊副教授鑒定為Tupistra chinensis Bak.，標(biāo)本存放于湖北省天然產(chǎn)物研究與利用重點實驗室（No.TC200207SNJ）。
2 方法
2.1 藥物制備開口箭根莖粉碎后，用甲醇回流提取，合并提取液，濃縮后經(jīng)氯仿脫脂后用水飽和的正丁醇萃取，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收正丁醇，濃縮液抽干后即得到開口箭總皂苷，配成水液，過大孔樹脂柱，水洗， 30%乙醇、70%乙醇、95%乙醇梯度洗脫，得開口箭4部分皂苷。分別取開口箭總皂苷、30%開口箭皂苷、70%開口箭皂苷兩個樣品，用PBS配制成所需濃度，依次為312.5，625，1 250，2 500，5 000，10 000 μg/ml， 70%開口箭皂苷用PBS配制成所需濃度，依次為156.25，312.5，625，1 250，2 500，5 000 μg/ml，所有受試樣品均用0.22 μm微孔濾膜過濾除菌。環(huán)磷酰胺 （CP）用DMSO將其配置為500 mg/ml。
2.2 細(xì)胞培養(yǎng) Hela和HepG2細(xì)胞用RPMI-1640培養(yǎng)液（另加10mmol/L HEPES、2.0 mg/mlNaHCO3、100 U/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素和10%新生小牛血清），于CO2孵箱中37℃，5%CO2飽和濕度下培養(yǎng)。貼壁細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化傳代。
2.3 開口箭活性部位對Hela和HepG2細(xì)胞殺傷作用最佳實驗條件的選擇MTT法實驗條件的初步優(yōu)化，主要是對溶解藥物的.溶劑（水、PBS）、加藥前的培養(yǎng)時間（6，12，24 h）、藥物劑量和細(xì)胞密度進(jìn)行了摸索。其中密度細(xì)胞分別取0.1×105，0.5×105，0.8×105，1×105個/ml,接種于96孔培養(yǎng)板，每孔接種100 μl，轉(zhuǎn)板24 h后加不同濃度的開口箭活性部位，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，以MTT法測定吸光度，比較不同細(xì)胞密度的線性關(guān)系。
2.4 MTT比色法［6］MTT比色法按Mosmann氏法略加改進(jìn)。將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為0.5×105個/ml,接種于96孔培養(yǎng)板，每孔接種100 μl，轉(zhuǎn)板24 h后加100 μl受試藥，另設(shè)陰性對照組（不加藥）、空白調(diào)零組（只有PBS）和陽性對照組（環(huán)磷酰胺組），每組均設(shè)3個復(fù)孔，培養(yǎng)48 h，吸棄上清后加MTT（5 mg/ml）100 μl,繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，棄去上清液，加DMSO 100 μl,用全自動酶聯(lián)免疫檢測儀于570 nm波長處測定吸光度（OD）值［7］，求出IC50。抑制率（%）=［陰性對照A570- 加藥組A570］/ 陰性對照A570×100%。
2.5 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期分1×106個細(xì)胞于培養(yǎng)瓶，陰性對照組0.5×106個細(xì)胞每瓶，培養(yǎng)24 h；吸棄部分上清后加藥混勻（開口箭總皂苷、30%皂苷終濃度2 500μg/ml，70%皂苷和環(huán)磷酰胺終濃度1 250 μg/ml），繼續(xù)培養(yǎng)48 h；于5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，收集上清于相應(yīng)標(biāo)簽離心管中，各加1 ml胰酶消化，加4 ml培養(yǎng)液于該培養(yǎng)瓶中，并一起吸至各相應(yīng)離心管中，各瓶加入5 ml PBS洗滌，洗滌液一起吸入相應(yīng)離心管中，以2 000 r/min離心5 min；吸棄上清，加入1 ml 80%乙醇和0.5 mmol/LEDTA（Na）2的PBS混合液懸起細(xì)胞，輕輕混勻，于4℃固定30 min；棄上清，加PBS 10 ml混勻，以2 000 r/min離心5 min；用500 μl含0.1%TritonX-100 和50 μg/ml RNase的PBS懸起細(xì)胞，轉(zhuǎn)置測定管中，加溴化丙錠PI 100 μl，避光染色17 min（一般15～20 min）；濾膜過濾后上機。
3 結(jié)果
開口箭活性部位對Hela和HepG2細(xì)胞殺傷作用最佳實驗條件的選擇為了得到相對穩(wěn)定并且可靠的實驗結(jié)果，通過前期預(yù)實驗并結(jié)合大量資料，對該MTT法實驗條件進(jìn)行了初步優(yōu)化，主要是對溶解藥物的溶劑、加藥前的培養(yǎng)時間、藥物劑量和細(xì)胞密度進(jìn)行了探索。對于溶劑，最初采用的溶劑是水，通過對照發(fā)現(xiàn)溶解藥物的水對細(xì)胞的影響很小，但并非沒有，所以正式實驗采用PBS溶解藥物；對于加藥前的培養(yǎng)時間采用了6，12，24 h 3個時間，通過顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)加藥前培養(yǎng)24 h細(xì)胞狀態(tài)良好，由此選用了加藥前培養(yǎng)24 h；
對于藥物劑量，通過多次預(yù)實驗，最終選擇了最高濃度開口箭總皂苷、30%皂苷為10 000 μg/ml，70%皂苷為5 000 μg/ml，而環(huán)磷酰胺為20 000 μg/ml；對于細(xì)胞密度，通過多次預(yù)實驗，采用5種細(xì)胞密度即0.1×105，0.5×105，0.8×105，1×105個/ml，同樣的藥物濃度情況下，開口箭活性部位對Hela細(xì)胞生長抑制呈最好線性關(guān)系的細(xì)胞密度是0.5×105 個/ ml，由此選擇最佳細(xì)胞濃度是0.5×105個/ml。通過這些因素的優(yōu)化，從而初步排除了其他非藥物因素對細(xì)胞的影響；而且這兩種腫瘤細(xì)胞的MTT實驗在同一批進(jìn)行實驗，排除了不同環(huán)境的干擾，從而得出實驗結(jié)果。
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